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巴豆為大戟科植物巴豆(CrotontigliumL．)的干燥成熟種子，主產(chǎn)于我國西南及福建、湖北、湖南、廣東、廣西等地。性辛，熱;有大毒，歸胃、大腸經(jīng)。內(nèi)服瀉下寒積、逐水消腫、祛痰利咽，外用蝕瘡，可用于惡瘡疥癬［1］。巴豆含脂肪油、蛋白質(zhì)和生物堿等物質(zhì)，其中巴豆總生物堿具顯著的生理活性，具有抗癌抗腫瘤作用，如能誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞凋亡［2－3］。但目前尚未見巴豆中生物堿具體化學(xué)成分組成的相關(guān)報道，亦無有關(guān)巴豆中總生物堿含量測定方面的文獻(xiàn)。已有研究表明木蘭花堿具有抗炎、降壓、抗生育等作用，可抑制α-葡萄糖苷酶活性［4］、抑制HERG鉀通道蛋白的表達(dá)等［5］。本試驗首次從巴豆中分離得到木蘭花堿，并以木蘭花堿為對照品，采用酸性染料比色法，首次建立了巴豆中總生物堿含量測定的方法，并比較了不同產(chǎn)地巴豆中總生物堿的含量，為巴豆藥材的質(zhì)量評價及巴豆總生物堿的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1·儀器與試劑

Thermo紫外-可見分光光度計、SsrtoriusBSA224S-CW萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)、SsrtoriusCP225D十萬分之一電子分析天平(廣州市正一科技有限公司)。10批巴豆藥材分別來源于四川、廣西、云南3個主產(chǎn)區(qū)(詳見表2)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)賴小平研究員鑒定為大戟科植物巴豆CrotontigliumL．的果實。木蘭花堿對照品(廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心提供，經(jīng)HPLC法測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%)。試驗試劑均為分析純，水為超純水。

2·方法與結(jié)果

2．1溶液的制備

2．1．1對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的木蘭花堿對照品4．91mg，置于10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取5mL，置50mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.0491mg·mL－1的對照品溶液。

2．1．2供試品溶液的制備取干燥巴豆細(xì)粉2.5g，加乙醚索氏提取3h去油后，藥渣用10倍量40%(體積分?jǐn)?shù))乙醇回流提取2次，每次40min，濾過，合并提取液，回收溶劑，定容至100mL容量瓶中，即得。

2．2酸性染料比色法條件的選擇

2．2．1測定波長的選擇精密吸取木蘭花堿對照品溶液2．8mL及供試品溶液1．0mL，分別加入pH6．0磷酸緩沖液至8mL。分別加入溴麝香草酚藍(lán)溶液3．5mL，三氯甲烷8mL，充分振搖3min后，靜止40min后分取三氯甲烷液。另取磷酸緩沖液8mL，同法操作得三氯甲烷液，作為空白溶液，分別在200～600nm進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液在420nm處均有穩(wěn)定的最大吸收，空白溶液則無吸收，如圖1所示，故選擇420nm為測定波長。

2．2．2酸性染料用量的選擇精密吸取木蘭花堿對照品溶液2mL，共6份，分別置于不同的分液漏斗中，加入pH6．0磷酸緩沖液至8mL，分別加入配制好的溴麝香草酚藍(lán)溶液2．0、2．5、3．0、3．5、4．0、4．5mL，其余按“2．2．1”項下同法操作。結(jié)果表明當(dāng)溴麝香草酚藍(lán)溶液加入量為3．5mL時吸光度最大，故選擇溴麝香草酚藍(lán)溶液的加入量為3．5mL。

2．2．3緩沖液pH的選擇分別配制pH值為5．6、5．8、6．0、6．2、6．5、6．8的磷酸緩沖鹽，精密吸取巴豆供試品溶液0．5mL、木蘭花堿對照品溶液2mL，共6份，其余按照“2．2．1”項下操作，分別在420nm處測定吸光度。結(jié)果表明供試品和對照品溶液均在pH6．0緩沖液中吸光度值最大，故選用pH值為6.0的緩沖液。

2．2．4緩沖液用量的選擇精密量取木蘭花堿對照品溶液2mL，共7份，分別置于7個分液漏斗中，分別加入pH6．0磷酸緩沖液至6、7、8、9、10、11、12mL，再加入配制好的溴麝香草酚藍(lán)溶液3．5mL，其余按“2．2．1”項下操作，結(jié)果表明加緩沖液至8～10mL時吸光度無明顯變化，為節(jié)省溶劑，選擇加入緩沖液至8mL。

2．3方法學(xué)考察

2．3．1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取木蘭花堿對照品液0．5、1．0、1．4、1．7、2．0、2．3、2．7、3．0mL，分別置于8個分液漏斗中，加pH值為6．0的磷酸緩沖液至8mL，其余操作按“2．2．1”項下進(jìn)行。以對照品質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=4．6291X－0．0098(r=0.9995)，結(jié)果表明木蘭花堿在0．0246～0．1473mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2．3．2精密度試驗分別精密吸取已顯色好的木蘭花堿對照品溶液2mL，依法測定6次，吸光度的RSD值為0．61%，表明儀器精密度良好。

2．3．3穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品(批號:20101122)溶液2mL，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h依法測定吸光值，結(jié)果RSD為0．76%，表明供試品溶液在3h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2．3．4重復(fù)性試驗精密稱取同一批樣品(批號:20101122)6份，各約2．5g，分別按“2．1．2”項下方法制備供試品溶液，按“2．2．1”項下方法測定吸光度，結(jié)果總生物堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．32%，RSD值為0．92%。

2．3．5加樣回收率試驗精密稱取已知含量的同一批巴豆粉末(批號:20101122)約0．5g，精密稱定，共6份，分別加入木蘭花堿對照品溶液適量，分別按“2．1．2”項下方法制備供試品溶液。分別精確吸取2．5mL，各加入pH6．0磷酸緩沖液6mL，其余按“2．2．1”項下方法操作，在420nm處測定吸光度，結(jié)果見表1。平均回收率為99．0%，RSD為2．75%。